TEST ELISA

  Sejarah ELISA

Sebelum pengembangan ELISA, satu-satunya pilihan untuk melakukan suatu immunoassay adalah radioimmunoassay, teknik menggunakan antigen berlabel radioaktif atau antibodi. Dalam radioimmunoassay, radioaktivitas memberikan sinyal, yang menunjukkan apakah suatu antigen tertentu atau antibodi hadir dalam sampel. Radioimmunoassay pertama kali dijelaskan dalam kertas oleh Rosalyn Sussman Yalow dan Salomo Berson diterbitkan pada tahun 1960. Sebuah mikrobiologi menggunakan enzim suatu Linked tes Assay (ELISA) immunosorbent, dalam rangka untuk mengembangkan metode untuk deteksi cepat antigen p24 HIV dalam sampel darah.

Karena radioaktivitas menimbulkan ancaman kesehatan potensial, alternatif yang lebih aman itu dicari. Sebuah alternatif yang cocok untuk radioimmunoassay akan mengganti sinyal non-radioaktif di tempat sinyal radioaktif. Ketika enzim (seperti peroksidase) bereaksi dengan substrat yang sesuai (seperti ABTS atau 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine), perubahan warna terjadi, yang digunakan sebagai sinyal. Namun, sinyal tersebut harus dikaitkan dengan keberadaan antibodi atau antigen, yang mengapa enzim harus dihubungkan dengan antibodi yang sesuai. Proses menghubungkan secara independen dikembangkan oleh Stratis Avrameas dan GB Pierce. Karena itu perlu untuk menghilangkan antibodi atau antigen terikat dengan mencuci, antibodi atau antigen harus tetap ke permukaan wadah;. Yaitu, immunosorbent telah harus dipersiapkan. Sebuah teknik untuk mencapai hal ini diterbitkan oleh Wide dan Jerker Porath pada tahun 1966. 

Pada tahun 1971, Petrus Perlmann dan Eva Engvall di Universitas Stockholm di Swedia, dan Anton Schuurs dan Bauke van Weemen di Belanda mandiri makalah yang disintesis pengetahuan ini ke dalam metode untuk melakukan EIA / ELISA.

 

  Pengertian ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang  tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.

Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang  spesifik untuk antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi  secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan  kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif.

Aplikasi ELISA

ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi  antibodi  dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam industri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA  juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.

ELISA adalah tes skrining dahulu banyak digunakan untuk HIV karena kepekaan tinggi. Dalam ELISA, serum seseorang diencerkan 400 kali lipat dan diterapkan pada pelat yang antigen HIV yang terpasang. Jika antibodi terhadap HIV hadir dalam serum, mereka dapat mengikat antigen HIV. Pelat ini kemudian dicuci untuk menghapus semua komponen lain dari serum. Sebuah "antibodi sekunder" khusus disiapkan - antibodi yang mengikat antibodi lain - kemudian diterapkan ke piring, mencuci diikuti oleh yang lain. Ini antibodi sekunder secara kimiawi terkait di muka untuk enzim.
"Anti IgG manusia" Antibodi Ganda Sandwich ELISA

Dengan demikian, piring akan berisi enzim sebanding dengan jumlah antibodi sekunder terikat ke piring. Sebuah substrat untuk enzim diterapkan, dan katalisis oleh enzim mengarah ke perubahan pada warna atau fluoresensi. Hasil ELISA dilaporkan sebagai nomor; aspek paling kontroversial dari tes ini adalah menentukan "cut-off" titik antara positif dan hasil negatif. Sebuah titik cut-off dapat ditentukan dengan membandingkannya dengan standar yang dikenal. Jika tes ELISA digunakan untuk skrining obat di tempat kerja, konsentrasi cut-off, 50 ng / mL, misalnya, didirikan, dan sampel yang berisi konsentrasi analit standar akan disiapkan. Diketahui bahwa menghasilkan sinyal yang lebih kuat daripada sampel dikenal adalah "positif." Mereka yang menghasilkan sinyal lemah, yang "negatif." Dokter Dennis E Bidwell dan Alister Voller menciptakan tes.

Kegunaan lain dari ELISA meliputi:

1. deteksi antibodi mikobakteri dalam TB.

2. deteksi rotavirus dalam tinja.

3. deteksi penanda hepatitis B dalam serum.

4. deteksi enterotoksin E. coli dalam tinja.

  Tipe-tipe ELISA

Ada beberapa tipe-tipe ELISA, diantaranya adalah sebagai berikut:

1.      Indirect ELISA

2.      Sandwich ELISA

3.      Competitive ELISA

 

  1.     Indirect ELISA

 

(Gambar Mekanisme Indirect ELISA)

Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi dalam serum adalah:

a)      Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar  yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.

b)      Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter.  Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.

c)      Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.

d)     Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.

e)      Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.

f)       Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.

g)      Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.

h)      Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya.

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang.

  2.     Sandwich ELISA

 

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

a)      Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’

b)      Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir

c)      Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate

d)     Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat

e)      Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan  antigen

f)       Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer

g)      Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang

h)      Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia

i)        Diukur absorbansinya  untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi.

Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

 

  3.     Competitive ELISA

Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas sebelumnya, yaitu:

a)      Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya

b)      Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigen

c)      Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi

d)     Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim

e)      Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/ fluoresensi.

Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:

 

Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut:

 

  4.     Beberapa dan Portable ELISA (M & P ELISA) (ELISA Reverse di makalah yang diterbitkan)

Sebuah teknik baru (EP 1 499 894 B1 di EPO Buletin 25.02.209 N. 2009/09; USPTO 7510687 di USPTO Buletin 2009/03/31; ZL 03.810.029,0 di SIPO RRC Buletin 2009/08/04) menggunakan fase padat terdiri dari polistiren immunosorbent batang dengan 8-12 ogives menonjol. Seluruh perangkat direndam dalam tabung reaksi berisi sampel dikumpulkan dan langkah-langkah berikut (cuci, inkubasi dalam conjugate dan inkubasi dalam chromogenous) dilakukan oleh mencelupkan ogives di microwells standar microplates pra-diisi dengan reagen.

Keuntungan dari teknik ini adalah sebagai berikut:

 Ø  Para ogives masing-masing dapat peka terhadap reagen yang berbeda, memungkinkan deteksi simultan dari antibodi yang berbeda dan / atau antigen yang berbeda untuk multi-target tes;

 Ø Volume sampel dapat ditingkatkan untuk meningkatkan sensitivitas tes di klinik (darah, air liur, urin), makanan (susu curah, telur dikumpulkan) dan (air) lingkungan sampel;

 Ø  Satu ogive yang tersisa unsensitized untuk mengukur reaksi non-spesifik sampel;

 Ø  Penggunaan perlengkapan laboratorium untuk mengeluarkan alikuot sampel, mencuci solusi dan reagen dalam microwells tidak diperlukan, memfasilitasi pengembangan siap menggunakan laboratorium-kit dan di tempat kit.

  5.     Material Dalam Metode ELISA

Ø  Antigen

Ø  Monoclonal Ab

Ø  Microplate

Ø  Blocking Buffer

Ø  Serum sample

Ø  Conjugate (secondary Ab + Enzyme)

Ø  Subtrate

Ø  Stop Sol.