Sejarah ELISA
Sebelum pengembangan ELISA, satu-satunya pilihan untuk melakukan suatu immunoassay adalah radioimmunoassay, teknik menggunakan antigen berlabel radioaktif atau antibodi. Dalam radioimmunoassay, radioaktivitas memberikan sinyal, yang menunjukkan apakah suatu antigen tertentu atau antibodi hadir dalam sampel. Radioimmunoassay pertama kali dijelaskan dalam kertas oleh Rosalyn Sussman Yalow dan Salomo Berson diterbitkan pada tahun 1960. Sebuah mikrobiologi menggunakan enzim suatu Linked tes Assay (ELISA) immunosorbent, dalam rangka untuk mengembangkan metode untuk deteksi cepat antigen p24 HIV dalam sampel darah.
Karena radioaktivitas menimbulkan ancaman kesehatan potensial, alternatif yang lebih aman itu dicari. Sebuah alternatif yang cocok untuk radioimmunoassay akan mengganti sinyal non-radioaktif di tempat sinyal radioaktif. Ketika enzim (seperti peroksidase) bereaksi dengan substrat yang sesuai (seperti ABTS atau 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine),
perubahan warna
terjadi, yang digunakan sebagai sinyal. Namun, sinyal tersebut harus dikaitkan dengan keberadaan antibodi atau antigen, yang mengapa enzim harus dihubungkan dengan antibodi yang sesuai. Proses menghubungkan secara independen dikembangkan oleh Stratis Avrameas dan GB Pierce. Karena itu perlu untuk menghilangkan antibodi atau antigen terikat dengan mencuci, antibodi atau antigen harus tetap ke permukaan wadah;. Yaitu, immunosorbent telah harus dipersiapkan. Sebuah teknik untuk mencapai hal ini diterbitkan oleh Wide dan Jerker Porath pada tahun 1966.
Pada tahun 1971, Petrus Perlmann dan Eva Engvall di
Universitas Stockholm di
Swedia, dan Anton Schuurs dan Bauke van Weemen di Belanda mandiri makalah yang disintesis pengetahuan ini ke
dalam metode untuk melakukan EIA / ELISA.
Pengertian ELISA
Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama
digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau
antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam
bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam
pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada
suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut,
sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim,
dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim
menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya
dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks
antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat
disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.
Penggunaan
ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen
tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada
suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik
yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui
penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang sama,
disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi
pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi
dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara langsung
oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di
antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut
untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah
tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik
untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen
dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun
metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih
sensitif.
Aplikasi ELISA
ELISA
dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya
merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi
antibodi dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi
kehadiran antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam industri makanan
untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut,
almond, dan telur. ELISA juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi
untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.
ELISA adalah tes
skrining dahulu banyak digunakan untuk HIV karena kepekaan tinggi. Dalam ELISA,
serum seseorang diencerkan 400 kali lipat dan diterapkan pada pelat yang
antigen HIV yang terpasang. Jika antibodi terhadap HIV hadir dalam serum,
mereka dapat mengikat antigen HIV. Pelat ini kemudian dicuci untuk menghapus
semua komponen lain dari serum. Sebuah "antibodi sekunder" khusus
disiapkan - antibodi yang mengikat antibodi lain - kemudian diterapkan ke
piring, mencuci diikuti oleh yang lain. Ini antibodi sekunder secara kimiawi
terkait di muka
untuk enzim.
"Anti IgG manusia" Antibodi Ganda Sandwich ELISA
Dengan demikian,
piring akan berisi enzim sebanding dengan jumlah antibodi sekunder terikat ke
piring. Sebuah substrat untuk enzim diterapkan, dan katalisis oleh enzim
mengarah ke perubahan pada warna atau fluoresensi. Hasil ELISA dilaporkan
sebagai nomor; aspek paling kontroversial dari tes ini adalah menentukan
"cut-off" titik antara positif dan hasil negatif.
Sebuah titik
cut-off dapat ditentukan dengan membandingkannya dengan standar yang dikenal.
Jika tes ELISA digunakan untuk skrining obat di tempat kerja, konsentrasi
cut-off, 50 ng / mL, misalnya, didirikan, dan sampel yang berisi konsentrasi
analit standar akan disiapkan. Diketahui bahwa menghasilkan sinyal yang lebih
kuat daripada sampel dikenal adalah "positif." Mereka yang menghasilkan sinyal lemah, yang "negatif."
Dokter Dennis
E Bidwell dan Alister Voller menciptakan tes.
Kegunaan lain dari
ELISA meliputi:
1. deteksi antibodi
mikobakteri dalam TB.
2. deteksi
rotavirus dalam tinja.
3. deteksi penanda
hepatitis B dalam serum.
4. deteksi enterotoksin E. coli dalam tinja.
Tipe-tipe ELISA
Ada
beberapa tipe-tipe ELISA, diantaranya adalah sebagai berikut:
1. Indirect ELISA
2. Sandwich ELISA
3. Competitive ELISA
1.
Indirect ELISA
(Gambar Mekanisme
Indirect
ELISA)
Tahap
umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi
konsentrasi antibodi dalam serum adalah:
a) Suatu
antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada
permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada
permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang
diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk
mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.
b) Suatu
larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum
albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate
mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein
serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.
c) Lubang
plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel
serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama
dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam
tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total
harus sama dengan antigen standar.
d) Plate
dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji
dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen
terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau
protein yang terbloking.
e) Antibodi
sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam
lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat
spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan
enzim.
f) Plate
dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.
g) Dimasukkan
substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/
fluorogenik/ elektrokimia.
h) Hasil
dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/
elektrokimia lainnya.
Enzim bertindak
sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap
terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama
dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya
non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate
mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus
berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang.
2.
Sandwich ELISA
Tahapan dalam Sandwich
ELISA adalah sebagai berikut:
a) Disiapkan permukaan untuk
mengikatkan antibodi ‘penangkap’
b) Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
c) Sampel berisi antigen dimasukkan
dalam plate
d) Plate dicuci untuk membuang kelebihan
antigen yang tidak terikat
e) Antibodi primer ditambahkan, supaya
berikatan secara spesifik dengan antigen
f) Antibodi sekunder yang berikatan
dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer
g) Plate dicuci, sehingga konjugat
antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang
h) Ditambahkan reagen yang dapat diubah
oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia
i)
Diukur
absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen
Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak
murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa
lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk
protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng,
menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi.
Prinsip kerja sandwich
ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:
3.
Competitive
ELISA
Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode
yang telah dibahas sebelumnya, yaitu:
a) Antibodi yang tidak berlabel
diinkubasi dengan kehadiran antigennya
b) Komplek antigen-antibodi ini
selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigen
c) Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi
tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang
dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah
disebut kompetisi
d) Ditambahkan antibodi sekunder yang
spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim
e) Substrat ditambahkan, enzim akan
mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/ fluoresensi.
Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen
orisinal, semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat
pada gambar berikut ini:
Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat
digambarkan sebagai berikut:
4.
Beberapa dan Portable ELISA (M & P ELISA) (ELISA Reverse di makalah yang
diterbitkan)
Sebuah teknik baru (EP 1 499 894 B1 di
EPO Buletin 25.02.209 N. 2009/09; USPTO 7510687 di USPTO Buletin 2009/03/31; ZL
03.810.029,0 di SIPO RRC Buletin 2009/08/04) menggunakan fase padat terdiri
dari polistiren immunosorbent batang dengan 8-12 ogives menonjol. Seluruh
perangkat direndam dalam tabung reaksi berisi sampel dikumpulkan dan
langkah-langkah berikut (cuci, inkubasi dalam conjugate dan inkubasi dalam
chromogenous) dilakukan oleh mencelupkan ogives di microwells standar
microplates pra-diisi dengan reagen.
Keuntungan dari teknik ini adalah
sebagai berikut:
Ø Para ogives masing-masing dapat peka
terhadap reagen yang berbeda, memungkinkan deteksi simultan dari antibodi yang
berbeda dan / atau antigen yang berbeda untuk multi-target tes;
Ø Volume sampel dapat ditingkatkan
untuk meningkatkan sensitivitas tes di klinik (darah, air liur, urin), makanan (susu
curah, telur dikumpulkan) dan (air) lingkungan sampel;
Ø Satu ogive yang tersisa unsensitized
untuk mengukur reaksi non-spesifik sampel;
Ø Penggunaan perlengkapan laboratorium
untuk mengeluarkan alikuot sampel, mencuci solusi dan reagen dalam microwells tidak
diperlukan, memfasilitasi pengembangan siap menggunakan laboratorium-kit dan di
tempat kit.
5.
Material
Dalam Metode ELISA
Ø Antigen
Ø Monoclonal
Ab
Ø Microplate
Ø Blocking
Buffer
Ø Serum
sample
Ø Conjugate
(secondary Ab + Enzyme)
Ø Subtrate
Ø Stop
Sol.